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【摘要】 目的考察不同廠家生產的虫草菌絲體化學成分的一致性。方法對應用蝙蝠蛾擬青霉菌和中華被毛孢菌發酵的不同廠家的6個產品的腺苷和多糖的含量，水提取液的HPLC指紋圖譜進行了考察。結果不同菌株發酵的虫草菌絲體中腺苷和粗多糖的含量存在差异，但蝙蝠蛾擬青霉菌和中華被毛孢菌兩種菌種之間發酵產物腺苷和粗多糖的含量未見明顯差异； 不同菌株的蝙蝠蛾擬青霉菌發酵產物非常相似，不同菌株的中華被毛孢菌發酵產物也很相似，但蝙蝠蛾擬青霉菌和中華被毛孢菌兩種菌種之間發酵產物明顯不同。結論結果揭示可以用HPLC指紋圖譜的方法對市場中的虫草菌絲體進行鑒定，明确其是否為國家批准使用的蝙蝠蛾擬青霉菌或中華被毛孢菌發酵獲得。
【關鍵詞】 冬虫夏草; 蝙蝠蛾擬青霉菌; 中華被毛孢菌; 高效液相色譜指紋圖譜
冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk．)Sacc．為麥角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫虫草蝙蝠蛾幼虫上的子座及幼虫屍體的復合體［1］，其性平，味甘，入肺、腎經，具有益精髓、補虛損、保肺、益腎、止血、化痰等功效，主要用于虛勞咳嗽、咯血盜汗、陽痿遺精、腰膝酸軟等症。現代葯理証明冬虫夏草具有擴張支氣管、控制心率、鎮靜催眠、雄激素樣等作用，還具有抗癌活性和抑制病菌、提高机體免疫功能等作用，是我國傳統滋補強壯的名貴中葯［2］，在中成葯和保健品中大量使用。隨著天然虫草在市場上應用的日益廣泛和無序的瘋狂采挖，天然虫草的資源正迅速枯竭。
我國在20世紀80年代初已經開始了人工培養冬虫夏草菌絲體的研究工作，並取得了很大進展。國家衛生部自1987年來陸續批准了“寧心寶膠囊”(治療心律失常)、“金水寶膠囊”(治療性功能底下、高脂血症、慢性支氣管炎等)及“至靈膠囊”(治療慢性腎功能不全、慢性腎炎、慢性乙肝等)等冬虫夏草制劑用于臨床［3，4］。
人工發酵虫草菌絲體主要來源于天然冬虫夏草中提取分離得到的真菌成分。至今，微生物學者報道從天然虫草中提取分離和鑒定的真菌菌株多達十余種，如菌株 1 Mortierella hepiali Chen & Liu (1979)，菌株 2 Stachybotrys sp. Kobayasi (1982), 菌株3 Paecilomyces hepiali Chen & Dai (1983)，菌株4 Paecilomyces sinensis Chen (1984)，菌株5 Cephlosporium sinensis Chen (1985)，菌株6 Cephlosporium dongchongxiacao Chen (1985)，菌株7 Scytalium sp. (1985)，菌株8 Scytalidium heliali Li (1988)，菌株9 Tolypocladium sinensis Li (1988)，菌株10Hirsutella sinensis Liu, Guo, Yu & Zeng (1989)，菌株11 Hirsutella hepiali Chen & Shen (1989)，菌株12 Synnematium sinensis Yin & Shen (1990)，菌株13 Chrysosporium sinensis Liang (1990)。其中有些菌種經后期的重新鑒定，其實為同一菌種，如菌株10，11，12均為菌種Hirsutella sinensis。 目前國家批准應用蝙蝠蛾擬青霉菌（Paecilomyces hepiali）和中華被毛孢菌（Hirsutella sinensis）發酵產物作為人工發酵的虫草菌絲體在中成葯和保健食品中使用，但商品名不得冠以冬虫夏草。
液體發酵虫草菌絲體的工藝目前已成熟，國內有多個廠家從事虫草菌絲體的生產。由于從冬虫夏草中獲得的菌種來源不同，命名又較為混亂，加上菌株在發酵過程中存在變异，為考察不同廠家生產的虫草菌絲體化學成分的一致性， 本文對應用蝙蝠蛾擬青霉菌和中華被毛孢菌發酵的不同廠家的產品的腺苷和多糖的含量、水提取液的HPLC指紋圖譜進行了考察。
1 儀器與試劑
1.1 儀器
Aglient 1100型高效液相色譜儀（ChemStation 工作站， G1316A柱溫箱、G1322A在線脫氣机、G1311A四元泵），紫外檢測器(G1314B ); Pharmacia C-18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) 色譜柱。 751分光光度計，上海分析儀器廠生產 。
1.2 試劑
腺苷（上海生工生物工程公司）、葡萄糖（國葯集團化學試劑廠），其他試劑均為色譜純或分析純。虫草菌絲體樣品: 分別購自浙江和江西的液體發酵蝙蝠蛾擬青霉菌（Paecilomyces hepiali）菌絲體樣品3個，命名為PH-1、PH-2和PH-3。分別購自浙江、江甦、山東的液體發酵中華被毛孢菌（Hirsutella sinensis）菌絲體樣品3個，命名為HS-1、HS-2和HS-3。
2 方法與結果
2.1 腺苷的含量測定［5］
2.1.1 對照品溶液的制備取腺苷對照品適量，用90％ 甲醇配成1 mg•ml-1 的對照品溶液。
2.1.2 供試品溶液的制備取樣品粗粉1 g，加90％ 甲醇40 ml，加熱回流30 min，過濾，濾液濃縮至干，殘渣以90％ 甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。
2.1.3 色譜條件Pharmacia C-l8 (4．6 mm×250 mm, 5 μm)為固定相，磷酸鹽緩沖液0.01 mol•ml-1 (pH 6.5)-甲醇(17∶3)為流動相，流速1.0 ml•min-1，檢測波長為280 nm。
2.1.4 標准曲線制定精密稱取適量腺苷標准品50 mg，置25 ml容量瓶中，加流動相溶解並稀釋至刻度，搖勻。精密量取0.1，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 ml置25 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻, 進樣20 μl，測得峰面積，以腺苷濃度為橫標，腺苷峰面積為縱坐標，求得線性回歸程為：Y=1.657×10-3X+0.045， r=0.999 1，結果表明腺苷在0.008 ～0.64 mg•ml-1 內線性關系良好。
2.1.5 精密度實驗分別取濃度為0.16 ，0.32 mg•ml-1 的腺苷標准品溶液，重復進樣5次，20 μl/次，對照品峰面積積分值的RSD 為0.33% 和0.17%。表明方法精密度良好。
2.1.6 穩定性實驗取濃度為 0.32 mg•ml-1的腺苷標准品溶液，在0，2，4，6，12 h分別進樣20 μl，記錄峰面積，結果5次進樣腺苷峰面積積分值RSD為0.75%。表明樣品溶液室溫放置12 h內穩定性良好。
2.1.7 重復性實驗取同批腺苷標准品，按“2.1.8”項下配制供試品溶液5份，分別進樣20 μl，記錄色譜圖，計算峰面積的RSD為0.67%，表明方法重復性良好。
2.1.8 含量測定分別取6個虫草菌絲體葯材粉末約0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加90％ 甲醇水溶液10 ml， 加熱回流30 min，放冷，濾過，濾渣再加90％甲醇水溶液10 ml， 加熱回流30 min，濾過，合並2次濾液，置25 mL容量瓶中，續補90％甲醇水溶液至刻度。分別進樣20 μl，按上述色譜條件測定，外標一點法計算含量。
結果6個樣品PH-1，PH-2，PH-3，HS-1，HS-2，HS-3 中所含腺苷的含量（%）依次為 0.16，0.21，0.15，0.23，0.16，0.10。
2.2 虫草粗多糖的含量測定［6］
2.2.1 標准曲線制定精密稱取葡萄糖標准品5 mg，置于100 ml容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度。分別精密吸取上述葡萄糖標准液0，0.4，0.7，1.0，1.3，1.6，2.0 ml于試管中，均精确補充蒸餾水至2.0 ml，分別加入5% 苯酚試液1.0 ml，搖勻，再加入濃硫酸5.0 ml， 立即用旋渦混合器混勻，室溫放置30 min后， 以標准液0 ml為空白，于490 nm處測定吸收值（D）。根据標准液濃度（C，mg•L-1）及吸收值可得回歸方程式 D = 0.054 5 C+ 0.057 3，r=0.998。
2.2.2 樣品制備
精密稱取冬虫夏草菌粉5 g，加蒸餾水約40倍，煮沸1 h，濾紙過濾收集濾液。濾渣再加約40倍蒸餾水煮沸1 h，收集濾液，重復2次。將3次濾液合並，濃縮至小體積，加入4倍量無水乙醇，4℃冰箱放置過夜，過濾，沉淀用純水溶解后定容至500 ml，此為虫草粗多糖提取液樣品。
2.2.3 粗多糖含量測定與提取率計算各吸取1 ml粗多糖樣品溶液，加入1 ml蒸餾水稀釋，按標准曲線操作步驟測定光密度，以標准曲線計算虫草粗多糖的含量。
結果6個樣品PH-1，PH-2，PH-3，HS-1，HS-2，HS-3中所含粗多糖的含量（%）依次為 5.9，7.3，5.2，6.3，5.7，7.8。
粗多糖含量（%）=根据標准曲線計算量×稀釋倍數樣品質量×100%
2.3 HPLC指紋圖譜比較
2.3.1 供試品溶液的制備取樣品粗粉0.5 g，加水40 ml，搖勻，加熱回流30 min，濾過，濾液加水定溶至50，作為供試品溶液。
2.3.2 色譜條件Pharmacia C-8 (4．6 mm×150 mm, 5μm)為固定相， 流動相為乙腈-水梯度洗脫(0～5 min, 5～35%乙腈; 5～20 min, 35～60%乙腈; 20～25 min, 60～90%乙腈), 流速1.0 ml•min-1，檢測波長為230 nm。結果見圖1～2。
3 討論
從實驗結果看出，不同菌株發酵的虫草菌絲體中腺苷和粗多糖的含量存在差异，但蝙蝠蛾擬青霉菌和中華被毛孢菌兩種菌種之間發酵產物腺苷和粗多糖的含量未見明顯差异。由于 收集的各菌株發酵菌絲體批號有限，未能對同一菌株各批次發酵物的差异進行觀察。
通過HPLC指紋圖譜看出，3個不同菌株的蝙蝠蛾擬青霉菌發酵產物非常相似，3個不同菌株的中華被毛孢菌發酵產物也很相似，但蝙蝠蛾擬青霉菌和中華被毛孢菌兩種菌種之間發酵產物明顯不同。此結果揭示可以用HPLC指紋圖譜的方法對市場中的虫草菌絲體進行鑒定，明确它是否是由國家批准使用的蝙蝠蛾擬青霉菌或中華被毛孢菌發酵獲得。
【參考文獻】
［1］鄭漢臣, 蔡少青. 葯用植物學與生葯學, 第4版［M］. 北京: 人民衛生出版社, 2003: 34.
［2］趙余慶, 于 明, 陳立君, 等.冬虫夏草屬真菌化學研究概況［J］.中草葯，1999, 30(12):950.
［3］揚朝寬, 侯淑彥, 于 靜, 等. 寧心寶膠囊治療心律失常［J］. 中國新葯與臨床雜志，1999, 9(5): 279.
［4］張敏和, 洪 量, 郭 群.高效液相色譜法測定發酵虫草菌粉和金水寶膠囊中腺苷的含量［J］.中草葯，1994, 25(2): 77.
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