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[ 美容 ] 中醫治療色素去斑方劑---摘錄自中保網

生技美容摘錄自中保網
摘　要　對中醫治療色素增加性皮膚病方劑69首進行電腦拆方排序，選出高頻次出現中藥82味，觀察這些中藥乙醇提取物對蘑菇酪氨酸酶和無細胞系統多巴色素自動氧化生成黑素量的影響。結果顯示11味中藥乙醇提取物在3個不同濃度對酪氨酸酶活性和黑素生成量呈劑量依賴性抑制，其中白術、白僵蠶、槁本、白芨、白附子、沙苑子、六月雪、柿葉對酪氨酸酶活性抑制率與單體化合物熊果苷無統計學差異(P＞0.05)。進一步研究這些中藥的皮膚脫色機制與評估其臨床應用價值是必要的。
關鍵字　中藥　酪氨酸酶　抑制劑　黑素　生物合成
　　酪氨酸酶(EC1.14.18.1)是黑素生物合成途徑中的主要限速酶［1，2］。大多數能使皮膚脫色的物質都通過抑制該酶活性來阻滯皮膚黑素生成，屬酪氨酸酶抑制型皮膚脫色劑(depigmenting agent)［2，3］。近十年來，從微生物［4］和植物藥［5～7］中分離天然的酪氨酸酶抑制劑已得到人們的普遍關注。它不但用於色素增加性皮膚病(黃褐斑、雀斑等)的臨床治療，而且可用於化妝品使膚色增白。本研究從古今中醫治療色素增加性皮膚病方劑中精選69首［8］進行拆方並將組藥輸入電腦排序，篩選出高頻次使用中藥82味，觀察這些中藥乙醇提取物對蘑菇酪氨酸酶和無細胞系統多巴色素自動氧化生成黑素量的影響。
1　材料
1.1　藥材：實驗用中藥生藥82味，按中藥在69首方劑中出現頻次由高至低依次爲：白芷(40.6%)、白附子(36.3%)、當歸(34.8%)、白茯苓(23.3%)、白僵蠶(20.3%)、甘草(18.8%)、紅花(17.4%)、白芍(17.4%)、白芨(17.4%)、川芎(15.9%)、赤芍(15.9%)、白蘞(15.9%)、白術(14.5%)、柴胡(14.5%)、香附(13.0%)、生地(10.1%)、薄荷(8.7%)、丹參(8.7%)、牡丹皮(8.7%)、槁本(8.7%)、女貞子、熟地、紫草、澤瀉、細辛、旱蓮草、何首烏、桃仁、雞血藤、生山梔、荊芥、龍膽草、枸杞子、陳皮、菟絲子、郁金、白鮮皮、生大黃、炙大黃、茵陳、黃精、益母草、合歡花、廣木香、獨活、月季花、珍珠母、莪術、北沙參、防風、夏枯草、黃芩、浮萍、六月雪、白蒺藜、蒼術、苦參、骨碎補、川烏、沙苑子、蛇床子、生商陸、炙商陸、蒼耳草、透骨草、白薇、降香、乳香、羌活、覆盆子、重樓、茺蔚子、桂枝、蓽茇、地膚子、土茯苓、桑椹子、八月紮、炙草烏、桔梗、柿葉(鮮)、馬齒莧(鮮)。以上中藥除鮮品爲本地自採外，其餘均爲生品，由嘉義大學生命科學院楊玲玲教授鑒定並提供。
1.2　試劑和儀器：L-多巴，蘑菇酪氨酸酶(Sigma産品)；熊果苷；其他試劑均爲市售分析純。分光光度計。
2　方法
2.1　中藥乙醇提取物的製備：中藥生藥粉碎，稱取細粉5 g，用90%的乙醇50～100 mL室溫下密閉浸泡2周，並不時振盪。濾過除渣收集乙醇提取液置沸水浴中，揮盡乙醇濃縮至稠膏狀。用1 mL二甲基亞碸溶解後置4℃冰箱凍存備用。臨用時用磷酸緩衝液稀釋至設定濃度。
2.2　酪氨酸酶活性測定［5，9］：將中藥提取物用0.2 mol/L pH6.8磷酸緩衝液1 mL稀釋後與蘑菇酪氨酸酶1 mL(100單位)混合，25℃孵育10 min。加入0.15%L-多巴反應液1 mL，繼續孵育2 min，立即於分光光度計475 nm處測光吸收值A475。中藥生藥終濃度設定爲：高(100 mg/mL)、中(50 mg/mL)、低(10 mg/mL)3個不同濃度。酪氨酸酶活性抑制率按下列公式計算：
抑制率(%)=(A-B)-(C-D)/［A-B］×100
式中　A=A475-藥+酶；B=A475-藥-酶；C=A475+藥+酶；
D=A475+藥-酶
　　此外另取4個濃度(50、100、500、1 000 μmol/L)的熊果苷水溶液爲藥物組陽性對照。
2.3　多巴色素自動氧化生成黑素量的測定：參照Matsuda等報導方法並稍加改良［9］。先將蘑菇酪氨酸酶1 mL(100單位)與0.15%L-多巴反應液1 mL混合，25℃孵育5 min。再加入不同濃度中藥1 mL，置25℃繼續孵育60 min。最後用1 mol/L鹽酸0.2 mL終止反應。將反應混合物離心3 000 r/min 15 min，棄上清液，沈澱物用6 mol/L鹽酸洗1次，雙蒸水洗2次，最後用1 mol/L氫氧化鈉3 mL充分溶解，離心團塊，置400 nm處測光吸收值A400。黑素生成抑制率用加藥組A400占空白對照組A400的百分率表示，即
抑制率(%)=1-(A400加藥組/A400空白對照組)×100
2.4　資料處理和統計方法：上述每一實驗均重復3次。所測實驗資料以 ±s表示，採用配對計量資料t檢驗進行統計學分析。
3　結果
　　82味中藥，僅有11味在高、中、低3個濃度均對酪氨酸酶活性和黑色素生成量呈劑量依賴性抑制，其中白術、白僵蠶、槁本、白芨、白附子、沙苑子、六月雪、柿葉乙醇提取物對酪氨酸酶活性的抑制率與熊果苷無統計學差異(P＞0.05)。詳見表1。對酶活性高濃度抑制低濃度啟動的有10味：白茯苓、甘草、白芍、細辛、蒼術、生商陸、桂枝、北沙參、防風、蓽茇。高濃度啟動低濃度抑制的有4味：白芷、生地、骨碎補、乳香。其餘作用不明顯。4種濃度的熊果苷均對酶活性呈抑制作用，且100μmol/L時最高，抑制率達67.86%；即使提高熊果苷濃度也不能增加其對酪氨酸酶的抑制。
4　討論
　　人們最早認識的皮膚脫色劑是分子結構與酪氨酸酶的底物類似的單酚類化合物氫醌［11］。通常一種酶的底物類似物常能抑制該酶活性［12］，按照這個思路又有許多能抑制酪氨酸酶活性的單酚或多酚化合物相繼被發現［11］。但氫醌及其它酚類化合物的外用製劑化學性質不穩定易氧化變色，尚有引起皮膚永久性白斑的報告［11］，限制了這類藥物的開發和臨床應用。1988年日本學者Akiu等從杜鵑花科植物熊果Arctostaphylos uva-ursi的葉中分離到一種具有脫色作用的單體物質熊果苷(arbutin)，自此從微生物和植物藥中分離天然酪氨酸酶抑制劑引起人們的興趣［11］。熊果苷是氫醌的一種天然存在形式，氫醌-β-D-葡萄吡喃糖苷(hydroquinone-β-D-glucopyranoside)其脫色作用推測仍可能與分子結構中存在的氫醌基團有關［1，3］。
　　本研究應用電腦拆方排序對69首治療色素增加性皮膚病的方劑組藥進行分析，依出現頻次篩選出中藥82味，觀察這些中藥乙醇提取物對蘑菇酪氨酸酶和無細胞系統多巴色素自動氧化生成黑素量的影響。從表1可看出11味中藥對酪氨酸酶呈抑制作用，其中白術、白僵蠶、槁本、白芨、白附子、沙苑子、六月雪、柿葉乙醇提取物對酪氨酸酶活性的抑制率與熊果苷無統計學差異(P＞0.05)，且黑素生成量減低與酪氨酶活性抑制相關。11味中藥有7味排序在前20位，占63.64%。而排序居第一位的白芷則對酪氨酸酶呈高濃度啟動低濃度抑制的雙向作用。
表1　中藥乙醇提取物對酪氨酸酶活性和黑素生成的抑制作用
*與100 μmol/L熊果苷相比P＞0.05
　　日本人研究發現傘形科(川芎、柴胡、防風、獨活、羌活、槁本、當歸、前胡)［5］、蓼科(大黃)［10］、杜鵑花科(熊果)［9］等植物有較高的酪氨酸酶抑制作用。本實驗僅發現傘形科槁本、柴胡、北沙參、防風和白芷對酪氨酸酶有抑制，川芎、獨活、羌活以及蓼科大黃則對酶呈啟動作用，與日本學者報告不一致［5，10］，是否與藥物使用濃度和産地來源不同有關?但我們從表中不能發現這些具有酪氨酸酶抑制作用的中藥間存在有植物分類學上的關聯。
　　用蘑菇酪氨酸酶和無細胞多巴色素自動氧化生成黑素體系大規模篩選皮膚脫色劑，方法簡單可靠。但蘑菇酪氨酸酶與哺乳動物細胞來源的酪氨酸酶畢竟存有差異［7］。用體外培養的人黑素細胞或B16F10鼠黑素瘤細胞進一步確認這些中藥對黑素生成影響是有必要的。

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